Місяк С.А.(1), Лукін С.М.(1), Голотюк В.В.(2), Корнієнко П.Л.(3), Тавокін В.В.(3), Вовк А.В.(1), Бурлака А.П.(1)

Вплив препарату з глини “Бента” на швидкість генерування супероксидних радикалів пухлинною тканиною та нейтрофілами крові хворих на рак прямої кишки.

(1)Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ., (2)ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет», (3)наукова лабораторія “Гармонія”, УКРТЕХМЕД, м. Київ.

Резюме. Мета дослідження: з’ясувати ефективність застосування фармакопейного продукту глини “Бента” в якості перехоплювача супероксидних радикалів, генерованих імунокомпетентними клітинами крові і пухлиною у хворих на рак прямої кишки.

Матеріал і методи. Дослідження були проведені на взірцях пухлин та нейтрофілах венозної крові 12 хворих з помірнодиференційованою аденокарциномою прямої кишки. Досліджували зміни супероксид-генеруючої активності НАДФ•Н-оксидази ізольованих нейтрофілів венозної крові та пухлинної тканини під впливом препарату з глини “Бента” методом електронного парамагнітного резонансу з використанням спінового уловлювача 1-гідрокси-2,2,6,6-тетраметил-4-оксипіперидину за кімнатної температури на комп’ютеризованому спектрометрі ЕПР РЕ-1307. В якості контролю використовували взірці кишки, відібрані на відстані 3-4 см від пухлини і лейкоцити донорської крові.

Результати. В результаті проведених досліджень встановлено, що мітохондрії клітин тканини умовно здорової кишки генерують супероксидні радикали зі швидкістю 0,28±0,04 нмоль/г пухлинної тк.•хв, аденокарциноми прямої кишки – 0,48±0,03 нмоль/г пухлинної тк.•хв. При додаванні препарату «Бента» цей показник знизився до значень 0,35±0,05 нмоль/г пухлинної тк.•хв. Показник супероксид-генеруючої активності НАДФ•Н-оксидази нейтрофілів у донорів визначався на рівні 0,23±0,03 нмоль/103 клітин•хв, тоді як у хворих на рак прямої кишки активність нейтрофілів склала 0,63±0,09 нмоль/103клітин•хв. Додавання препарату «Бента» до суспензії нейтрофілів супроводжувалось зниженням зазначеного показника до 0,45±0,06 нмоль/103 клітин•хв.

Висновки. Виявлена нова характеристика фармакопейного продукту глини “Бента”, а саме її спроможність виступати в якості перехоплювача супероксидних радикалів, генерованих як імунокомпетентними клітинами крові хворих на рак прямої кишки, так і джерелами клітин паренхіматозних структур, зокрема аденокарциномою прямої кишки.

Ключові слова: глина, супероксидний радикал, нейтрофіли, рак прямої кишки, реабілітація.

Постановка проблеми і аналіз останніх досліджень.

Важливим напрямком медицини на сучасному етапі є розробка та широке впровадження в практику технологій, засобів і методів попередження та лікування хронічних захворювань. З цією метою можуть бути використані речовини природного походження, які впливають на обмінні процеси та підсилюють функціональну активність систем організму, підвищуючи природну резистентність. До таких речовин слід віднести препарати глини, що складаються з одного або декількох глинистих мінералів: каолініту, монтморилоніту, сапоніту чи інших шаруватих алюмо- і магнієсилікатів, що мають специфічні властивості. Серед останніх виділяють іонообмінні, сорбційні, каталітичні, цитопротекторні, можливість регуляції кислотно-лужної рівноваги в організмі а також функцію молекулярного сита [2, 4, 5].

Монтморилоніт (-m Mg3 [Si4O10] [ОН] 2} • p {Al, Fe•••) 2 [Si4O10] [ОН] 2) • nН2O) – тришаровий силікат, сформований з двох тетраедричних і одного октаедричного шару, розташованого між ними. У мінералах монтморилоніту між пакетами розташовуються молекули води. Для мінералів цієї групи характерні широкі ізоморфні заміщення Si4+ на Al3+, надлишкові негативні заряди компенсуються при цьому іонами Ca, Na, K та ін., що розташовуються разом з молекулами води між пакетами. Кількість води між пакетами може змінюватися в широких межах, з чим пов'язана висока сорбційна та іонообмінна здатність монтморилоніту. Монтморилоніт – це основний мінерал глини, що володіє лікувальними властивостями. Взірці глини з високим вмістом (більше 45%) монтморилоніту називають бентонітовими. Мінерали монтморилонітової групи володіють практично всіма властивостями природних нанорозмірних частинок. Щоб природні наночастинки за своїми властивостями могли перевершувати штучні наноматеріали, необхідно використовувати бентонітові глини високої якості з вмістом монтморилоніту 85 - 95% [2].

Лікувальні якості глини з давніх здавен використовували в народній медицині. Сьогодні цей ефективний лікувальний засіб було витіснено сильнодіючими хімічними препаратами і забутий. В останні роки вчені знову звернулися до досліджень цієї унікальної природної, нетоксичної речовини і доводять незаперечну користь препаратів з глини при лікуванні хворих з різноманітними захворюваннями [6].

Мета дослідження: з’ясувати ефективність застосування фармакопейного продукту глини “Бента” в якості перехоплювача супероксидних радикалів, генерованих імунокомпетентними клітинами крові і пухлиною у хворих на рак прямої кишки (РПК).

Матеріал і методи дослідження.

Дослідження були проведені на взірцях пухлин та нейтрофілах венозної крові 12 хворих на РПК (5 чоловіків та 7 жінок, середній вік складав 62±1,8 років). Гістологічний тип пухлини в усіх хворих – помірнодиференційована аденокарцинома. У всіх пацієнтів діагноз, стадію захворювання і наявність метастазів верифіковано відповідно до вимог доказової медицини (в ході відповідних клініко-інструментальних обстежень, морфологічно). Критеріями виключення хворих при проведенні дослідження були: вік більше 80 років; первинно-множинний характер пухлинного ураження; загальний важкий стан хворих при перебуванні в стаціонарі, зумовлений наявністю супутніх соматичних захворювань в стадії декомпенсації; прийом вітамінів-антиоксидантів хворими за місяць до початку і під час проведення досліджень. Дослідження виконували у відповідності до принципів проведення біомедичних досліджень за участю людей, викладеними в Гельсінській декларації Всесвітньої медичної асоціації. В якості антикоагулянта використовували 3%-ий розчин трилону Б. В пробірку з 1 мл трилону Б набирали 5 мл крові з ліктьової вени і поміщали в холодильник для її зсідання упродовж 40 хв. Нейтрофіли виділяли згідно методики [7]. 250 мкл очищеної фракції нейтрофілів використовували для визначення рівнів швидкості генерування О2.. 500 мг пухлини гомогенізували в скляному гомогенізаторі вручну з додаванням 0,5 мл фосфатного буфера рН=7,4. З отриманого гомогенату відбирали 250 мкл, вливали в спеціальну кварцову кювету і досліджували швидкість генерування супероксидних радикалів. В якості контролю використовували взірці кишки, відібрані на відстані 3-4 см від пухлини. Дослідження супероксид-генеруючої активності НАДФ•Н-оксидази пухлинно-асоційованих нейтрофілів та пухлинної тканини проводили методом електронного парамагнітного резонансу з використанням спінового уловлювача 1-гідрокси-2,2,6,6-тетраметил-4-оксипіперидину за кімнатної температури на комп’ютеризованому спектрометрі ЕПР РЕ-1307 [1, 3]. 1 мг препарату з глини “Бента” (відповідно до методичних рекомендацій МОЗ України від 17.09.2008 р.) розводили в 1 мл дистильованої води, відстоювали. 10 мкл надосаду додавали до нейтрофілів і гомогенату пухлини для дослідження впливу “Бенти” на супероксид-генеруючу активність НАДФ•Н-оксидази та клітин пухлини. Статистичний аналіз виконували за допомогою прикладних ліцензійних програм Origin 7.0 та SPSS 17.0.

Результати дослідження та їх обговорення.

В результаті проведених досліджень була з’ясована середня швидкість генерування супероксидних радикалів мітохондріями слизової оболонки прямої кишки на відстані 4 см від пухлини, клітин РПК та мітохондріями клітин аденокарциноми при додаванні препарату «Бента» (рис.1), (р<0,05).

Рис. 1. Швидкість генерування супероксидних радикалів (нмоль/г • хв):

1) Клітини інтактної слизової оболонки прямої кишки; 2) Клітини РПК; 3) Аденокарцинома прямої кишки з додаванням «Бенти» (концентрація 1:10).

 Компоненти, які формують склад препарату «Бента» в умовах in vitro, проникаючи в мітохондрії клітин пухлини, знижують рівень генерування супероксидних радикалів в електронотранспортному ланцюгу. Так, якщо мітохондрії клітин тканини умовно здорової кишки генерують супероксидні радикали зі швидкістю 0,28±0,04 нмоль/г пухлинної тк.·хв., аденокарциноми прямої кишки – 0,48±0,03 нмоль/г пухлинної тк.•хв. то при додаванні препарату «Бента» цей показник знизився до значень 0,35±0,05 нмоль/г пухлинної тк.•хв.

Рис. 2. Швидкість генерування супероксидних радикалів НАДФ•Н-оксидазою нейтрофільних гранулоцитів (нмоль / 10³ клітин • хв): 1 – донорів; 2 – хворих на РПК; 3 – хворих на РПК при додаванні препарату «Бента» (концентрація 1:10).

         Аналіз отриманих результатів оцінки стану супероксид-генеруючої активності нейтрофілів периферичної крові хворих на РПК та вплив на ці процеси препарату «Бента» свідчить, що складові компоненти препарату володіють властивостями перехоплювачів супероксидних радикалів, або впливають на процеси переносу електронів на молекулярний кисень, знижуючи за цим механізмом сумарний рівень радикалу кисню. Так, показник активності НАДФ•Н-оксидази у донорів визначався на рівні 0,23±0,03 нмоль/10³ клітин•хв., тоді як у хворих на РПК активність нейтрофілів склала 0,63±0,09 нмоль/10³клітин•хв. Додавання препарату «Бента» до суспензії нейтрофілів супроводжувалось зниженням зазначеного показника до 0,45±0,06 нмоль/10³ клітин•хв.

Висновки. Таким чином, нами виявлена нова характеристика фармакопейного продукту глини “Бента”, а саме її спроможність виступати в якості перехоплювача супероксидних радикалів, генерованих як імунокомпетентними клітинами крові хворих на РПК, так і джерелами клітин паренхіматозних структур, зокрема аденокарциномою прямої кишки. Впровадження використання фармакопейного продукту із глини, який складається із одного або декількох глинистих мінералів – каоліну, монтморилоніту, сапоніту або інших шаруватих алюмо- та магнієсилікатів є перспективним для застосування у відновлювальних процедурах онкологічних хворих в умовах реабілітаційних центрів і в санаторно-курортних закладах.

Література.

1. Бурлака А.П. Радикальні форми кисню та оксиду азоту при пухлинному процесі / А.П. Бурлака, Є.П. Сидорик.- К.: Наукова думка, 2006. – 227 с.
2. Успенская М.Е. Минералогия с основами кристаллографии и петрографии: уч. пос / М.Е. Успенская, Т.В. Посухова - М.: Диалог-МГУ, 2006. – 124 с.
3. Effects of radical oxygen species and NO: formation of intracellular hypoxia and activation of matrix metalloproteinases in tumor tissues / Burlaka А.P., Sidorik E.P., Ganusevich І.І. [et al.] //  Exp Oncol.- 2006.- Vol. 28.- P. 49–53.
4. Mittal K.C. Electro and physico chemical properties of indian clay loam / K.C. Mittal, O.P. Bansal // Journal für Praktische Chemie.- 1968.- Vol. 38, N. 5-6.- P. 257-259.
5. Lipson S.M. Adsorption of reovirus to clay minerals: Effects of cationexchange capacity, cation saturation, and surface area / S.M. Lipson, G. Stotzky // Appl Environ Microbiol.- 1983.- Vol. 46.- P. 673–682.
6. Abehsera M. The Healing Power Of Clay: The Natural Remedy for Dozens of Common Ailments / M. Abehsera.- Kesington Publishing Corp., New York, 2001.- 185 p.
7. Tocotrienols-induced inhibition of platelet thrombus formation and platelet aggregation in stenosed canine coronary arteries / Qureshi A, Karpen Ch, Qureshi N, et al. // Lipids in Health and Disease.- 2011.- Vol. 10.- P. 58-71.