Мисяк С.А. (1), Лукин С.Н. (1), Голотюк В.В. (2), Корниенко П.Л. (3), Тавокин В.В. (3), Волк А.В. (1), Бурлака А.П. (1)
Влияние препарата с глиной "Бента" на скорость генерирования супероксидных радикалов опухолевой тканью и нейтрофилами крови больных раком прямой кишки.
(1) Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины,. Киев. (2) ДВНЗ «Ивано-Франковский национальный медицинский университет» (3) научная лаборатория "Гармония", УКРТЕХМЕД., Г. Киев.
Резюме. Цель исследования: выяснить эффективность применения фармакопейного продукта глины "Бента" в качестве перехватчика супероксидных радикалов, генерируемых иммунокомпетентными клетками крови и опухолью у больных раком прямой кишки.
Материал и методы. Исследования были проведены на образцах опухолей и нейтрофилах венозной крови 12 больных с умереннодиференцированною аденокарциномой прямой кишки. Исследовали изменения супероксид-генерирующей активности НАДФ • Н-оксидазы изолированных нейтрофилов венозной крови и опухолевой ткани под влиянием препарата из глины "Бента" методом электронного парамагнитного резонанса с использованием спиновой ловушки 1-гидрокси-2,2,6,6-тетраметил-4 оксипиперидину при комнатной температуре на компьютеризированном спектрометре ЭПР РЕ-1307. В качестве контроля использовали образцы кишки, отобранные на расстоянии 3-4 см от опухоли и лейкоциты донорской крови.
Результаты. В результате проведенных исследований установлено, что митохондрии клеток ткани условно здоровой кишки генерируют супероксидных радикалов со скоростью 0,28 ± 0,04 нмоль / г опухолевой тк. • мин, аденокарциномы прямой кишки - 0,48 ± 0,03 нмоль / г опухолевой тк . • мин. При добавлении препарата «Бента» этот показатель снизился до значений 0,35 ± 0,05 нмоль / г опухолевой тк. • мин. Показатель супероксид-генерирующей активности НАДФ • Н-оксидазы нейтрофилов у доноров определялся на уровне 0,23 ± 0,03 нмоль / 103 клеток • мин, тогда как у больных раком прямой кишки активность нейтрофилов составила 0,63 ± 0,09 нмоль / 103клитин • мин. Добавление препарата «Бента» к суспензии нейтрофилов сопровождалось снижением указанного показателя до 0,45 ± 0,06 нмоль / 103 клеток • мин.
Выводы. Обнаружена новая характеристика фармакопейного продукта глины "Бента", а именно ее способность выступать в качестве перехватчика супероксидных радикалов, генерируемых как иммунокомпетентными клетками крови больных раком прямой кишки, так и источниками клеток паренхиматозных структур, в частности аденокарциномой прямой кишки.
Ключевые слова: глина, супероксидных радикалов, нейтрофилы, рак прямой кишки, реабилитация.
Постановка проблемы и анализ последних исследований.
Важным направлением медицины на современном этапе является разработка и широкое внедрение в практику технологий, средств и методов предупреждения и лечения хронических заболеваний. С этой целью могут быть использованы вещества природного происхождения, которые влияют на обменные процессы и усиливает функциональную активность систем организма, повышая естественную резистентность. К таким веществам следует отнести препараты глины, состоящие из одного или нескольких глинистых минералов: каолинита, монтмориллонита, сапонита или других слоистых алюмо- и магниесиликатив, имеющие специфические свойства. Среди последних выделяют ионообменные, сорбционные, каталитические, цитопротекторные, возможность регуляции кислотно-щелочного равновесия в организме а также функцию молекулярного сита [2, 4, 5].
Монтмориллонит (-m Mg3 [Si4O10] [ОН] 2} • p {Al, Fe •••) 2 [Si4O10] [ОН] 2) • nН2O) - трехслойный силикат, сформированный из двух тетраэдрических и одного октаэдрического слоя, расположенного между ними. В минералах монтмориллонита между пакетами располагаются молекулы воды. Для минералов этой группы характерны широкие изоморфные замещения Si4 + на Al3 +, избыточные отрицательные заряды компенсируются при этом ионами Ca, Na, K и др., Располагаются вместе с молекулами воды между пакетами. Количество воды между пакетами может изменяться в широких пределах, с чем связана высокая сорбционная и ионообменная способность монтмориллонита. Монтмориллонит - это основной минерал глины, обладающий лечебными свойствами. Образцы глины с высоким содержанием (более 45%) монтмориллонита называют бентонитовыми. Минералы монтморилонитовои группы обладают практически всеми свойствами природных наноразмерных частиц. Чтобы природные наночастицы по своим свойствам могли превосходить искусственные наноматериалы, необходимо использовать бентонитовые глины высокого качества с содержанием монтмориллонита 85 - 95% [2].
Лечебные качества глины с давних издавна использовали в народной медицине. Сегодня этот эффективное лечебное средство было вытеснено сильнодействующими химическими препаратами и забыт. В последние годы ученые вновь обратились к исследованиям этой уникальной природной, нетоксичного вещества и доводят неоспоримую пользу препаратов из глины при лечении больных с различными заболеваниями [6].
Цель исследования: выяснить эффективность применения фармакопейного продукта глины "Бента" в качестве перехватчика супероксидных радикалов, генерируемых иммунокомпетентными клетками крови и опухолью у больных раком прямой кишки (РПК).
Материал и методы исследования.
Исследования были проведены на образцах опухолей и нейтрофилах венозной крови 12 больных РПК (5 мужчин и 7 женщин, средний возраст составлял 62 ± 1,8 лет). Гистологический тип опухоли у всех больных - помирнодиференцийована аденокарцинома. У всех пациентов диагноз, стадию заболевания и наличие метастазов верифицированы в соответствии с требованиями доказательной медицины (в ходе соответствующих клинико-инструментальных обследований, морфологически). Критериями исключения больных при проведении исследования были: возраст более 80 лет; первично-множественный характер опухолевого поражения; общее тяжелое состояние больных при нахождении в стационаре, обусловленный наличием сопутствующих соматических заболеваний в стадии декомпенсации; прием витаминов-антиоксидантов больными за месяц до начала и во время проведения исследований. Исследования выполняли в соответствии с принципами проведения биомедицинских исследований с участием людей, изложенными в Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации. В качестве антикоагулянта использовали 3% -ный раствор трилона Б. В пробирку с 1 мл трилона Б набирали 5 мл крови из локтевой вены и помещали в холодильник для ее свертывания в течение 40 мин. Нейтрофилы выделяли по методике [7]. 250 мкл очищенной фракции нейтрофилов использовали для определения уровней скорости генерирования О2 .. 500 мг опухоли гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе вручную с добавлением 0,5 мл фосфатного буфера рН = 7,4. Из полученного гомогената отбирали 250 мкл, вливали в специальную кварцевую кювету и исследовали скорость генерирования супероксидных радикалов. В качестве контроля использовали образцы кишки, отобранные на расстоянии 3-4 см от опухоли. Исследование супероксид-генерирующей активности НАДФ • Н-оксидазы опухоль-ассоциированных нейтрофилов и опухолевой ткани проводили методом электронного парамагнитного резонанса с использованием спинового ловушки 1-гидрокси-2,2,6,6-тетраметил-4-оксипиперидину при комнатной температуре на компьютеризированном спектрометре ЭПР РЕ-1307 [1, 3]. 1 мг из глины "Бента" (в соответствии с методическими рекомендациями Минздрава Украины от 17.09.2008 г..) Разводили в 1 мл дистиллированной воды, отстаивали. 10 мкл надосаду добавляли нейтрофилов и гомогената опухоли для исследования влияния "Бент" на супероксид-генерирующую активность НАДФ • Н-оксидазы и клеток опухоли. Статистический анализ выполняли с помощью прикладных лицензионных программ Origin 7.0 и SPSS 17.0.
Результаты исследования и их обсуждение.
В результате проведенных исследований была выяснена средняя скорость генерирования супероксидных радикалов митохондриями слизистой оболочки прямой кишки на расстоянии 4 см от опухоли, клеток РПК и митохондриями клеток аденокарциномы при добавлении препарата «Бента» (рис.1), (р <0,05) .
Рис. 1. Скорость генерации супероксидных радикалов (нмоль / г • мин):
1) Клетки интактной слизистой оболочки прямой кишки; 2) Клетки РПК; 3) Аденокарцинома прямой кишки с добавлением «Бенто» (концентрация 1:10).
Компоненты, которые формируют состав препарата «Бента» в условиях in vitro, проникая в митохондрии клеток опухоли, снижают уровень генерирования супероксидных радикалов в електронотранспортному цепи. Так, если митохондрии клеток ткани условно здоровой кишки генерируют супероксидных радикалов со скоростью 0,28 ± 0,04 нмоль / г опухолевой тк. · Мин., Аденокарциномы прямой кишки - 0,48 ± 0,03 нмоль / г опухолевой тк. • мин . то при добавлении препарата «Бента» этот показатель снизился до значений 0,35 ± 0,05 нмоль / г опухолевой тк. • мин.
Рис. 2. Скорость генерации супероксидных радикалов НАДФ • Н-оксидазы нейтрофилов (нмоль / 103 клеток • мин): 1 - доноров; 2 - больных РПК; 3 - больных РПК при добавлении препарата «Бента» (концентрация 1:10).
Анализ полученных результатов оценки состояния супероксид-генерирующей активности нейтрофилов периферической крови больных РПК и влияние на эти процессы препарата «Бента» свидетельствует, что компоненты препарата обладают свойствами перехватчиков супероксидных радикалов, или влияют на процессы переноса электронов на молекулярный кислород, снижая по этому механизму суммарный уровень радикала кислорода. Так, показатель активности НАДФ • Н-оксидазы у доноров определялся на уровне 0,23 ± 0,03 нмоль / 103 клеток • мин., Тогда как у больных РПК активность нейтрофилов составила 0,63 ± 0,09 нмоль / 103клитин • мин . Добавление препарата «Бента» к суспензии нейтрофилов сопровождалось снижением указанного показателя до 0,45 ± 0,06 нмоль / 103 клеток • мин.
Выводы. Таким образом, нами обнаружена новая характеристика фармакопейного продукта глины "Бента", а именно ее способность выступать в качестве перехватчика супероксидных радикалов, генерируемых как иммунокомпетентными клетками крови больных РПК, так и источниками клеток паренхиматозных структур, в частности аденокарциномой прямой кишки. Внедрение использования фармакопейного продукта из глины, состоящий из одного или нескольких глинистых минералов - каолина, монтмориллонита, сапонита или других слоистых алюмо- и магниесиликатив является перспективным для применения в восстановительных процедурах онкологических больных в условиях реабилитационных центров и в санаторно-курортных учреждениях.
Литература.
Бродяга А.П. Радикальные формы кислорода и оксида азота при опухолевом процессе / А.П. Бродяга, Е.П. Сидорик.- К .: Наукова думка, 2006. - 227 с.
Успенская М.Е. Минералогия с основами Кристаллография и петрографии: уч. пос / М.Е. Успенская, Т.В. Посухова - М .: Диалог-МГУ, 2006. - 124 с.
Effects of radical oxygen species and NO: formation of intracellular hypoxia and activation of matrix metalloproteinases in tumor tissues / Burlaka А.P., Sidorik E.P., Ganusevich И.И. [Et al.] // Exp Oncol.- 2006.- Vol. 28.- P. 49-53.
Mittal K.C. Electro and physico chemical properties of indian clay loam / K.C. Mittal, O.P. Bansal // Journal für Praktische Chemie.- 1968.- Vol. 38, N. 5-6.- P. 257-259.
Lipson S.M. Adsorption of reovirus to clay minerals: Effects of cationexchange capacity, cation saturation, and surface area / S.M. Lipson, G. Stotzky // Appl Environ Microbiol.- 1983.- Vol. 46.- P. 673-682.
Abehsera M. The Healing Power Of Clay: The Natural Remedy for Dozens of Common Ailments / M. Abehsera.- Kesington Publishing Corp., New York, 2001.- 185 p.
Tocotrienols-induced inhibition of platelet thrombus formation and platelet aggregation in stenosed canine coronary arteries / Qureshi A, Karpen Ch, Qureshi N, et al. // Lipids in Health and Disease.- 2011.- Vol. 10.- P. 58-71.